Jacqueline Bernheim Award

Plotse dood ten gevolge van levensbedreigende hartritmestoornissen is en blijft een belangrijk gezondheidszorgprobleem. Cx43-hemikanalen zijn een nieuw ionkanaalmechanisme betrokken bij levensbedreigende ritmestoornissen. Cx43, een belangrijk cardiaal connexine-eiwit, vormt hemikanalen die zich ophopen ter hoogte van de intercalaire schijf en vormen gapjuncties. Hoewel gapjuncties cruciaal zijn voor de elektrische geleiding in het hart, is er weinig bekend over de mogelijke rol van hemikanalen. Sterker nog, er werd lang gedacht dat hemikanalen niets meer dan inactieve precursoren voor gapjuncties waren. Recent bewijs suggereert evenwel dat inhibitie van Cx43-hemikanaalopening met Gap19 anti-aritmische effecten heeft. Door gebruik te maken van meerdere elektrofysiologische, beeldvormende en superresolutietechnieken werd het mechanisme van Cx43-hemikanaalactivatie in ventriculaire hartspiercellen en hun impact op de elektrische stabiliteit bestudeerd. Cx43-hemikanalen worden geactiveerd tijdens diastolische Ca²⁺-vrijstelling in ventriculaire hartspiercellen. De opening van Cx43-hemikanalen zorgt voor Ca²⁺-influx in een microdomein dat ryanodinereceptoren kan activeren. Op deze manier kan Cx43-hemikanaalopening leiden tot massieve Ca²⁺-vrijstelling in hartspiercellen die bijdraagt aan nadepolarisaties in de actiepotentiaal. Deze nadepolarisaties kunnen vroegtijdige actiepotentialen induceren die aritmogeen zijn. In hartspierweefsel van patiënten met eindstadium hartfalen werd een verhoogde hemikanaalactiviteit gevonden die bijdraagt aan elektrische instabiliteit. Selectieve inhibitie van Cx43-hemikanalen met Gap19 kan elektrische stabiliteit herstellen. Bovendien vonden andere onderzoeksgroepen een rol voor Cx43-hemikanalen, en hun inhibitie via Gap19, in ventriculaire ritmestoornissen geassocieerd aan Duchenne musculaire dystrofie en aritmogene rechterventrikelcardiomyopathie. We concluderen dat microdomeinkoppeling tussen Cx43-hemikanalen en cellulaire Ca²⁺-homeostase een nieuw, behandelbaar mechanisme is dat bijdraagt aan levensbedreigende hartritmestoornissen die plotse dood kunnen veroorzaken.

Plotse dood

Plotse dood is een van de belangrijkste doodsoorzaken in de westerse wereld. Gedefinieerd als een plots natuurlijk overlijden ten gevolge van een vermoedelijke cardiale oorzaak, is plotse dood hoofdzakelijk het gevolg van levensbedreigende ritmestoornissen zoals ventrikeltachycardie of -fibrillatie.¹ Desondanks majeure wetenschappelijke vooruitgang blijft de medische, maatschappelijke en economische impact van plotse dood onaanvaardbaar hoog.² Niettegenstaande de brede verspreiding van reanimatievaardigheden en automatische externe defibrillatoren, vooruitgang in (post)reanimatiezorg en de introductie van anti-aritmica, interne defibrillatoren en katheterablatie, blijft plotse dood wereldwijd miljoenen mensenlevens per jaar eisen (0,1 % per jaar).³ Er is dus een grote nood aan innovatief wetenschappelijk onderzoek naar de oorzaken en pathofysiologie van plotse dood en levensbedreigende hartritmestoornissen om nieuwe strategieën voor preventie en behandeling te ontwikkelen.²

Connexines in het hart

Algemeen gezien wordt aritmie gekarakteriseerd door een abnormale elektrische activatie van de hartspier. Het menselijke hart bestaat uit miljarden hartspiercellen waarvan de elektrische en contractiele eigenschappen beïnvloed worden door interactie met endotheelcellen, fibroblasten, gladde spiercellen, immuuncellen en het autonome zenuwstelsel.⁴ In deze complexe omgeving is strikt geregelde intercellulaire communicatie noodzakelijk voor het goed functioneren van de hartspier. Hierbij zijn er twee cruciale elementen: de elektrische prikkelbaarheid van de hartspiercellen en de elektrische propagatie van het elektrische signaal.⁵ Op moleculair niveau wordt de elektrische exciteerbaarheid van het hartspierweefsel voorzien door ionkanalen die de hartspiercellen depolariseren en repolariseren en zo de cardiale actiepotentiaal genereren. Elektrische signalen die gegenereerd worden in de sinusknoop worden doorgegeven in het gespecialiseerde conductiesysteem zodat de hartspier synchroon kan samentrekken en bloed naar de circulatie kan pompen. In het hart zijn connexine (Cx)-eiwitten abundant en combineren ze in hemi- en gapjunctiekanalen. Cardiale gapjuncties dirigeren de voortgeleiding van elektrische en chemische signalen in het hartspierweefsel en geleidingssysteem. Zo synchroniseren ze de hartcyclus en verzekeren ze een adequate pompfunctie.

Gapjuncties vormen de meest directe vorm van cel-celcommunicatie door een directe verbinding tot stand te brengen tussen het cytoplasma van aangrenzende cellen. De bouwstenen van deze juncties worden gecodeerd door 21 genen in het menselijke lichaam.⁶ In het hartspierweefsel worden vier connexine-isotypes tot expressie gebracht: Cx43, Cx40, Cx45 en Cx31.9 (figuur 1).⁷ Cx43 is het belangrijkste connexine-eiwit in de hartkamers, maar wordt ook tot expressie gebracht in de atria en de purkinjevezels. Cx40 bevindt zich in de voorkamers en in het intraventriculaire conductiesysteem, Cx45 in het volledige conductiesysteem en Cx31.9 uitsluitend in de sinusknoop. Na transcriptie en translatie oligomeriseren connexine-eiwitten tot een hexamere structuur die vervolgens als hemikanaal over het cytoskelet naar de plasmamembraan wordt getransporteerd. In hartspiercellen vormen deze hemikanalen gapjuncties aan de intercalaire schijven door onderlinge interactie (figuur 2 en 3). Hoewel hemikanalen normaal gezien gesloten zijn, openen ze zich tijdens de vorming van gapjunctiekanalen. Gap junctionele plaques bestaan uit duizenden intercellulaire gapjunctiekanalen die van cruciaal belang zijn voor het doorgeven van signalen in het hart. De organisatie in plaques zorgt voor een veilige koppelingsreserve, gezien het fysiologische belang van gapjuncties.⁸ In ziekteomstandigheden neemt de expressie van connexines af, wat resulteert in een verminderde koppelingsreserve. Dat kan leiden tot verstoorde intercellulaire communicatie, vertraagde impulspropagatie en het ontstaan van aritmieën.⁷ Vanwege de essentiële rol van gapjuncties op basis van Cx43 in het hart leiden pathogene varianten vaak tot miskraam of wiegendood.^{9, 10} Voor Cx40, Cx43 en Cx45 zijn ook pathogene varianten beschreven die geassocieerd zijn met atriale fibrillatie of conductiepathologie.^11-13 Bij verworven hartspierziekten, zoals ischemisch hartlijden, kleplijden en hartspierziekten, zorgen pathofysiologische veranderingen voor een gestoorde functie van connexinekanalen. Dat gaat gepaard met vermindering van de densiteit van gapjuncties, connexines die remodelleren en herdistribueren weg van de intercalaire schrijf. Hierdoor is de impulsconductie verstoord.⁷ In het verleden is een duidelijke en reproduceerbare relatie aangetoond tussen cardiale gapjuncties, ritmestoornissen en plotse dood. Gapjuncties zijn dus belangrijk zowel in het gezonde hart als bij hartziekten.

De membraantopologie van connexine-eiwitten omvat vier transmembraandomeinen die worden verbonden door twee extracellulaire lussen en één cytoplasmatische lus. De C- en N-termini van connexines bevinden zich in het cytoplasma. Zes connexine-eiwitten oligomeriseren om een hemikanaal te vormen. Twee van deze hemikanalen op aangrenzende cellen interageren en vormen zo een gapjunctiekanaal.

Gezien het pathofysiologische belang van gapjuncties in het hart zijn in het verleden verschillende moleculen ontwikkeld om gapjuncties te moduleren. Danegaptide en rotigaptide zijn de enige gapjunctiemodulatoren die uiteindelijk in een klinisch onderzoekstraject zijn opgenomen en waarvan is aangetoond dat ze veilig zijn in klinische fase I-onderzoeken.^{14, 15} Fase II klinische onderzoeken waarin rotigaptide en danegaptide worden geëvalueerd als anti-aritmica of als aanvullende therapie voor myocardischemie werden gestart sinds 2005, maar zijn vroegtijdig beëindigd (ClinicalTrials.gov identifiers: NCT00137332, NCT00137293).^{8, 16, 17} De fase II klinische studie met rotigaptide voor de preventie van ventriculaire aritmieën werd strategisch stopgezet om prioriteit te geven aan de ontwikkeling van danegaptide. Een klinische fase II-studie kon geen voordeel aantonen van danegaptide als aanvulling op percutane coronaire interventie om infarctgrootte te beperken.¹⁵ Tot nu toe zijn er geen andere geneesmiddelen klinisch getest die zich richten op connexinekanalen. Door de teleurstellende resultaten van klinische studies naar gapjunctiemodulatoren, is er een interesse ontstaan voor andere vormen van connexine-signalisatie, zoals via hemikanalen.

Cx43-hemikanalen en ventriculaire ritmestoornissen

Meer recent is overduidelijk geworden dat hemikanalen daadwerkelijk een functionele rol spelen in cardiovasculaire aandoeningen. Cx43-hemikanalen manifesteren zich op diverse cellulaire locaties in hartspiercellen, zoals ter hoogte van de intercalaire schijf en in organellen zoals mitochondria.^{8, 15, 16} Hoewel hemikanalen normaal gesproken gesloten zijn, kunnen ze worden geactiveerd door ontstekingsmediatoren, een toename van intracellulaire Ca²⁺-concentratie, membraandepolarisatie of posttranslationele modificaties.⁸ Een geopend Cx43-hemikanaal fungeert als een niet-selectieve porie met een hoge conductantie, waardoor ongecontroleerde instroom van ionen zoals Na⁺ en Ca²⁺ mogelijk is. Ook het verlies van K⁺, kleine metabolieten en signaalmoleculen vindt plaats.⁸ Op deze manier verbaast het niet dat het openen van slechts enkele hemikanalen een aanzienlijke invloed kan hebben op de membraanpotentiaal, intracellulaire Ca²⁺-homeostase en het celmetabolisme. Het bewijs voor cardiale effecten van Cx43-hemikanaalopening is afkomstig uit preklinische studies, met bevestiging in het menselijke hartspierweefsel.

Preklinisch onderzoek heeft aangetoond dat Cx43-hemikanalen betrokken zijn bij kamerritmestoornissen en plotse dood bij Duchenne musculaire dystrofie^{19, 20} en aritmogene rechterventrikelcardiomyopathie.²¹ De onderliggende pathofysiologie binnen deze studies wees in de richting van een gestoorde intracellulaire Ca²⁺-homeostase en een rol van adrenerge stress, maar het precieze mechanisme bleef onopgehelderd en werd niet bevestigd in humaan myocardium. Recent bewijs geeft echter aan dat Cx43-hemikanalen ruimtelijk nauw zijn geassocieerd (binnen 10 nanometer) met ryanodinereceptoren (RyR), waardoor gespecialiseerde microdomeinen ontstaan.^{22, 23} Tijdens excitatie-contractiekoppeling openen RyR-kanalen massaal, waardoor Ca²⁺ het sarcoplasmatische reticulum verlaat en een hartspiercontractie initieert. Adrenerge stress kan leiden tot een overbelasting van het sarcoplasmatische reticulum met spontane Ca²⁺-vrijlating, die via het Na⁺/Ca²⁺-uitwisselingstransport (NCX) naar buiten wordt gebracht. Dat veroorzaakt nadepolarisaties tijdens de actiepotentiaal, zogenaamde delayed afterdepolarizations. Als hierbij de drempelpotentiaal wordt bereikt, volgt vroegtijdig een nieuwe actiepotentiaal, wat resulteert in een voortijdige hartslag. Een dergelijke vroegtijdige elektrische activatie kan kameraritmie veroorzaken en leiden tot plotse dood. Een recente studie toont aan dat Cx43-hemikanaalopening dit mechanisme versterkt: moleculaire interacties tussen RyR's en hemikanalen, samen met een toename van intracellulair Ca²⁺, leiden tot hemikanaalopening, waardoor ionen zoals Na⁺ en Ca²⁺ de cel binnendringen.²³ Na⁺ heeft een direct depolariserend effect, terwijl binnenkomend Ca²⁺ de cel verlaat via NCX-transport en naburige RyR kan activeren, wat de depolarisatie verder versterkt (figuur 4). Dit resulteert in meer delayed afterdepolarizations met een verhoogd risico op voortijdige contractie. Deze bevindingen werden bevestigd in humane ventriculaire cardiomyocyten en menselijk hartspierweefsel afkomstig van patiënten met eindstadium hartfalen. Bij patiënten met ischemische en gedilateerde cardiomyopathie vertonen Cx43-hemikanalen een hogere activiteit. Het hemikanaal-RyR-microdomein is hierbij verantwoordelijk voor pro-aritmogene elektrische veranderingen.^{22, 23}

Cx43-hemikanaalopening resulteert in depolariserende elektrische stroom ten gevolge van influx van positief geladen ionen. Aanvullend zorgt de Ca-influx in het Cx43-hemikanaal-RyR (dyad)-domein voor een lokale stijging van de intracellulaire Ca²⁺-concentratie die Ca²⁺-golven en NCX-activatie kan veroorzaken die leiden tot meer en sterkere delayed afterdepolarisations en vroegtijdige actiepotentialen die pro-aritmogeen zijn.

Farmacologie van cardiale Cx43-hemikanalen: veelbelovend voor de toekomst

Een belangrijk deel van de bovenstaande studies rond cardiale Cx43-hemikanalen maakt gebruik van connexine mimetische peptiden die gebaseerd zijn op een specifieke sequentie van het Cx43-eiwit en zo interageren met specifieke eiwitdomeinen om de functie ervan te beïnvloeden. Hierdoor kunnen ze meer specifiek connexines moduleren. één zo een molecule, het Gap19-peptide, gebaseerd op een sequentie van de cytoplasmatische lus, interageert specifiek met de C-terminus van het Cx43-eiwit. Op deze manier inhibeert Gap19 specifiek Cx43-hemikanalen zonder gapjuncties te inhiberen.^{8, 17} Dit tweeledige effect is meer uitgesproken bij het peptide RRNYRRNY, dat oorspronkelijk ontworpen is om de sluiting van gapjuncties te voorkomen.⁸

Het RRNYRRNY-peptide remt, net zoals Gap19, zowel Cx43-hemikanalen in de plasmamembraan als in mitochondria¹⁶ Gap19 en RRNYRRNY bieden bescherming tegen ischemiereperfusie^{16, 17} en Gap19 voorkomt ventriculaire aritmie en plotse dood in diermodellen van aritmogene rechterventrikelcardiomyopathie²¹ en Duchenne musculaire dystrofie.²⁰ Ten slotte voorkomt Gap19 elektrische instabiliteit in ventriculair hartspierweefsel van patiënten met ischemische en gedilateerde cardiomyopathie.²³ Deze veelbelovende bevindingen benadrukken dat Gap19-peptide, en mogelijk ook het RRNYRRNY-peptide, potentiële kandidaten zijn voor verdere ontwikkeling en bevestiging in translationele modellen.

Daarnaast moet ook RyRHCIp worden genoemd, een Cx43-hemikanaal remmend peptide dat interfereert met de interactie tussen Cx43 en RyR.²²

Besluit

Zowel gapjuncties als hemikanalen gebaseerd op Cx43 blijken een pro-aritmogene rol te spelen in ventriculaire ritmestoornissen en plotse dood. Farmacologische benaderingen gericht op het herstellen van de Cx43 gap junctionele disfunctie in hartziekten laten echter geen voordelen zien in klinische onderzoeken. Specifieke inhibitoren van Cx43-hemikanalen zijn beloftevol voor verdere studie en klinische ontwikkeling.

Referenties

1. Zeppenfeld, K., Tfelt-Hansen, J., de Riva, M., Winkel BG, Behr ER, Blom NA. et al. 2022 ESC Guidelines for the management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Eur Heart J, 2022, 43 (40), 3997-4126.
2. Marijon, E., Narayanan, K., Smith, K., Barra, S., Basso, C., Blom, M.T. et al. The Lancet Commission to reduce the global burden of sudden cardiac death: a call for multidisciplinary action. Lancet, 2023, 402 (10405), 883-936.
3. Hayashi, M., Shimizu, W., Albert, C.M. The Spectrum of Epidemiology Underlying Sudden Cardiac Death. Circ Res, 2015, 116 (12), 1887-1906.
4. Pinto, A.R., Ilinykh, A., Ivey, M.J., Kuwabara, J.T., D'Antoni, M.L.D., Debuque, R. et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circ Res, 2016, 118 (3), 400-409.
5. van Veen, T.A.B., Stein, M., Royer, A., Le Quang, K., Charpentier, F., Colledge, W.H. et al. Impaired impulse propagation in Scn5aknockout mice: combined contribution of excitability, connexin expression, and tissue architecture in relation to aging. Circulation, 2005, 112 (13), 1927-1935.
6. Willecke, K., Eiberger, J., Degen, J., Eckardt, D., Romualdi, A., Güldenagel, M. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome. Biol Chem, 2002, 383 (5), 725-737.
7. Severs, N.J., Bruce, A.F., Dupont, E., Rothery, S. Remodelling of gap junctions and connexin expression in diseased myocardium. Cardiovasc Res, 2008, 80 (1), 9-19.
8. Leybaert, L., Lampe, P.D., Dhein, S., Kwak, B.R., Ferdinandy, P., Beyer, E.C. et al. Connexins in Cardiovascular and Neurovascular Health and Disease: Pharmacological Implications. Pharmacol Rev, 2017, 69 (4), 396-478.
9. Reaume, A., de Sousa, P., Kulkarni, S., Langille, B., Zhu, D., Davies, T. et al. Cardiac malformation in neonatal mice lacking connexin43. Science, 1995, 267 (5208), 1831-1834.
10. Van Norstrand, D.W., Asimaki, A., Rubinos, C., Dolmatova, E., Srinivas, M., Tester, D.J. et al. Connexin43 mutation causes heterogeneous gap junction loss and sudden infant death. Circulation, 2012, 125 (3), 474-481.
11. Gollob, M.H., Jones, D.L., Krahn, A.D., Danis, L., Gong, X-Q., Shao, Q. et al. Somatic mutations in the connexin 40 gene (GJA5) in atrial fibrillation. N Engl J Med, 2006, 354 (25), 2677-2688.
12. Thibodeau, I.L., Xu, J., Li, Q., Liu, G., Lam, K., Veinot, J.P. et al. Paradigm of genetic mosaicism and lone atrial fibrillation: Physiological characterization of a connexin 43-deletion mutant identified from atrial tissue. Circulation, 2010, 122 (3), 236-244.
13. Li, R.G., Xu, Y.J., Ye, W.G., Li, Y.J., Chen, H., Qiu, X.B., Yang, Y.Q., Bai, D. Connexin45 (GJC1) loss-of-function mutation contributes to familial atrial fibrillation and conduction disease. Heart Rhythm, 2021, 18 (5), 684-693.
14. Kj&‌oslash;lbye, A.L., Haugan, K., Hennan, J.K., Petersen, J.S. Pharmacological Modulation of Gap Junction Function with the Novel Compound Rotigaptide: A Promising New Principle for Prevention of Arrhythmias. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2007, 101 (4), 215-230.
15. Engstr&‌oslash;m, T., Nepper-Christensen, L., Helqvist, S., Kl&‌oslash;vgaard, L., Holmvang, L., J&‌oslash;rgensen, E. et al. Danegaptide for primary percutaneous coronary intervention in acute myocardial infarction patients: a phase 2 randomised clinical trial. Heart, 2018, 104, 1593-1599.
16. Zhang, X.S., Xiang, B.R. Discontinued drugs in 2008: cardiovascular drugs. Expert Opin Investig Drugs, 2009, 18 (7), 875-885.
17. De Vuyst, E., Boengler, K., Antoons, G., Sipido, K.R., Schulz, R., Leybaert L. Pharmacological modulation of connexinformed channels in cardiac pathophysiology. Br J Pharmacol, 2011, 163 (3), 469.
18. Vermij, S.H., Abriel, H., van Veen, T.A.B. Refining the molecular organization of the cardiac intercalated disc. Cardiovasc Res, 2017, 113 (3), 259-275.
19. Lillo, M.A., Himelman, E., Shirokova, N., Xie, L-H., Fraidenraich, D., Contreras, J.E. S-nitrosylation of Connexin43 hemichannels elicits cardiac stress induced arrhythmias in Duchenne Muscular Dystrophy mice. JCI Insight, 2019, 4 (24).
20. Himelman, E., Lillo MA, Nouet J, Gonzalez JP, Zhao Q, Xie L-H. et al. Prevention of Connexin43 remodeling protects against duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy. J Clin Invest, 2020.
21. Kim, J-C., Pérez-Hernández, M., Alvarado, F.J., Maurya, S.R., Montnach, J., Yin, Y. et al. Disruption of Ca 2+ i Homeostasis and Connexin 43 Hemichannel Function in the Right Ventricle Precedes Overt Arrhythmogenic Cardiomyopathy in Plakophilin-2-Deficient Mice. Circulation, 2019, 140 (12), 1015-1030.
22. Lissoni, A., Hulpiau, P., Martins-Marques, T., Wang, N., Bultynck, G., Schulz, R. et al. RyR2 regulates Cx43 hemichannel intracellular Ca2+-dependent activation in cardiomyocytes. Cardiovasc Res, 2021, 117 (1), 123-136.
23. De Smet, M.A.J., Lissoni, A., Nezlobinsky, T., Wang, N., Dries, E., Pérez-Hernández, M. et al. Cx43 hemichannel microdomain signaling at the intercalated disc enhances cardiac excitability. J Clin Invest, 2021, 131 (7).
24. Wang, N., De Vuyst, E., Ponsaerts, R., Boengler, K., Palacios-Prado, N., Wauman, J. et al. Selective inhibition of Cx43 hemichannels by Gap19 and its impact on myocardial ischemia/reperfusion injury. Basic Res Cardiol, 2013, 108 (1), 309.